鼠尾直接PCR试剂盒(快速基因型鉴定)

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1. 组织消化

1.1. 按小鼠数量配制组织消化液，试剂比例如下：

单样本 Protease Plus 2 μL Buffer L 100 μL

组织消化液现用现配，充分混匀后使用。

1.2. 向每个含有样本的EP管中加入100 μL新鲜组织消化液，55℃水浴/金属浴中消化15 min。组织消化时，务必将组织完全浸没于消化液中。消化完成后，组织外观上仍然完整，但足量的基因组DNA已经释放，不影响后续的PCR实验。

1.3. 将样本置于95℃水浴/金属浴中孵育5 min以灭活消化液中的蛋白酶活性。12000 rpm离心5分钟，取上清作为PCR模板。消化后的上清或连同组织的消化液可于-20℃保存三个月。

2. PCR扩增

2.1. PCR反应体系：

反应体系的配制最好于低温环境下（如冰浴）完成，以保证PCR扩增效率和扩增特异性。

PCR 反应组分 20 μL 反应体系 (μL) 50 μL 反应体系 (μL) ddH2O 8 21 正向引物 (10 μM) 0.5 1 反向引物 (10 μM) 0.5 1 模板（消化产物） 1 2 2 x M-PCR OPTI Mix 10 25

注：模板体积可以适当调整。

2.2. PCR反应条件：

温度 (℃) 时间循环数 94 5 min 1 94 20 sec 35 50-65 30 sec 72 X min (2 kb /min) 72 5 min 1 12 -- 1

PCR产物的3’端带有碱基A，可直接克隆至T载体，用于DNA测序。

3. 琼脂糖凝胶电泳

试剂2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚蓝染料，PCR产物可直接点样进行琼脂糖凝胶电泳。

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